Kromatografi Kertas

Satu keuntungan utama KKt ialah kemudahan dan kesederhanaannya pada pelaksanaan pemisahan, yaitu hanya pada lembaran kertas saring yang berlaku sebagai medium pemisahan dan juga sebagai penyangga. Keuntungan lain ialah keterulangan bilangan Rp yang besar pada kertas sehingga pengukuran Rp merupakan para­meter yang berharga dalam memaparkan senyawa tumbuhan baru. Memang, untuk senyawa antosianin yang tidak mempunyai ciri fisika lain yangjelas, Rjr adalah sarana terpenting dalam memaparkan dan membedakan pigmen yang satu dengan pigmen yang lain (Harborne, 1967).

Kromatografi pada kertas biasanya melibatkan kromatografi pembagian atau penjerapan. Pada kromatografi pembagian, senyawa terbagi dalam pelarut alkohol yang sebagian besar tidak bercampur dengan air (misalnya n-butanol) dan dalam air. Campuran pelarut klasik yaitu n-butanol-asam asetat-air (4:1: 5, lapisan atas) (di-singkat BAA),;memang dirancang sebagai sarana untuk meningkatkan kadar air lapisan n-butanol dan dengan demikian memperbaiki manfaat campuran pelarut tersebut. Memang, BAA masih tetap dipakai secara luas sebagai pengembang umum untuk banyak golong-an kandungan tumbuhan. Sebaliknya, gayajerap merupakan salah satu ciri utama KKt dalam pengembang air. Air murni ialah pengembang kromatografi yang sungguh-sungguh serba guna dan dapat digunakan untuk memisahkan purina dan pirimidina biasa, dan secara umum dapat dipakai juga untuk senyawa fenol dan glikosida tumbuhan.

Pemilihan radas untuk KKt, sampai batas tertentu, bergantung pada luas ruang laboratorium yang tersedia. Misalnya, KKt datar dan lingkar memerlukan tempat yang sedikit lebih luas daripada bejana KLT baku. Daya pisah kromatografi kertas betul-betui baik dan digunakan, misalnya, untuk memisahkan karotenoid. Di kebanyakan laboratorium, KKt dilakukan dengan cara menurun dalam sebuah bejana yang dapat menampung kertas Whatman berukuran 46 X 57 cm. KKt menurun adalah yang paling berguna karena pengembang dapat dengan lebih mudah dibiarkan lewat ujung bila diperlukan. Cara ini juga sedikit lebih mudah untuk pemisahan dua arah.

Untuk mencapai pemisahan dengan teknik kromatografi tertentu, dalam perdagangan tersedia berbagai jenis kertas saring yang sudah dimodifikasi. Misalnya, sifat polar selulosa dapat dikurangi dengan memadukan asam silikat atau alumina ke dalam kertas sehingga lebih cocok untuk memisahkan lipid. Kertas dapat dimodifikasi juga di laboratorium, misalnya dengan merendamnya dalam parafin atau minyak silikon agar dapat digunakan untuk kromatografi fase-balik, juga untuk lipid. Untuk pemisahan skala besar dapat dibeli lembaran kertas saring kromatografi yang tebal (Whatman no. 3 atau 3MM), dan kertas scmacam ini dapat menampung beberapa mg senyawa per lembar. Pada KKt, senyawa biasanya dideteksi sebagai bcrcak ber-wama atau bercak berfluoresensi-UV setelah direaksikan dengan pereaksi kromogenik yang digunakan sebagai pereaksi semprot atau pereaksi celup. Untuk lembaran besar, pencelupan biasanya lebih mudah tetapi susunan pereaksi semprot harus diubah agar mudah kenng, dan dengan demikian mencegah difusi waktu pencelupan. Selanjutnya kertas dapat dipanaskan untuk menimbulkan wama.

Bilangan R_F adalah jarak yang ditempuh senyawa pada kromatografi, "isbi terhadap garis depan. Bilangan Rp diperoleh dengan mengukur jarak antara titik awal dan pusat bercak yang dihasilkan senyawa, dan jarak mi kemudian dibagi dengan jarak antara titik awal dan garis depan (yaitu jarak yang ditempuh cairan pengembang). Bilangan ini selalu berupa pecahan dan terletak antara 0,01 dan 0,99. Afcan. Lebih mudah bila bilangan fcrsebut dikalikan 100, dan bilangan Rp dalam buku ini dinyatakan sebagai Rp (X.100). Kadatig-kadang R_F (X100) dinyatakan sebagai hR_F

Bila kita membandingkan bilangan Rp dari suatu deret senyawa yang strukturnya berkaitan, ada manfaatnya bila kita memperhatikan tetapan kromatografi lain, yaitu bilangan R^ . Kaitan antara R_M dan rf dinyatakan dalam persamaan:

R_M       = log (1/Rf -1)

Menghubungkan gerakan kromatografi dengan struktur kimia ada faedahnya karena bilangan ∆R_M dalam deret homolog biasanya tetap. Jadi, pada senyawa flavonoid, ∆R_M tetap untuk sejumlah substitusi hidroksil dan glikosil yang ada dalam molekul (Bate-Smith dan Westall, 1956). Prosedur ini dapat digunakan untuk menghitung bilangan Rp dari senyawa anggota yang belum diketahui dalam suatu deret senyawa untuk mcmpermudah pencarian senyawa tertcntu dalam ekstrak tumbuhan. Prosedur yang dcm^kian digunakan, misal-nya, dalam pencirian (karakterisasi) etcr metil kemferol yang baru. Ternyata bilangan R_F yang dihitung dan R_F yang sebenarnya sangat bersesuaian (tabel 1.1) (Harborne, 1969).

Di antara pustaka yang sangat banyak, yang membahas KKt, ada satu pengantar yang berguna yang ditulis untuk pemula, yaitu buku karangan Peereboom (1971). Buku mengenai KKt yang bernilai, terutama sebagai sumber data rf , ialah buku karangan Lederer dan Lederer (1957), Linskens (1959), serta Sherma dan Zweig (1971).

Sumber :

J.B. Harborne. 2006. Metode Fitokimia.Bandung (terbitan kedua): ITB