KCKT dapat disamakan dengan KGC dalam hal kepekaan dan kemampuannya menghasikan data kualitatif dan kuantitatif dengan sekali kerja saja. Perbedaannya ialah fase diam yang terikat pada poli-mer berpori terdapat dalam kolom baja tahan karat yang bergaris tengah kecil, dan fase gerak cair mengalir akibat tekanan yang besar. Alat KCKT lebih mahal daripada alat KGC, terutama karena diperlukan sistem pompa yang cocok serta semua sambungan harus disekrup sgar dapat menahan tekanan. Fase geraknya adalah campuran pelarut ys-ng dapat bercampur. Campuran ini dapat tetap susunannya (penusahan isokratik) atau dapat diubah perbandingannya secara sinambung dengan menambahkan ruang pencampur kepada susunan alat (elusi landaian), Senyawa dipantau ketika keluar dari kolom dengan mcnggunakan pendeteksi, biasanya dengan mengukur spek-trum serapan UV. Dapat ditambahkan pemadu (integrator) untuk mengolah data yang dihasilkan dan seluruh pekerjaan dapat diken-dalikan dengan mikroprosesor.Perbedaan utama antara KCKT dan KGC ialah bahwa cara pertama biasanya dilakukan pada suhu kamar sehingga senyawa tidak men-dapat perlakuan yang memungkinkan terjadinya tatasusun-ulang termal selama pemisahan. Tetapi, mungkin saja pengendalian suhu kolom KCKT menguntungkan pada pemisahan kritis sehingga mungkin diperlukan selubung yang dikendalikan dengan termostat. Kolom, yang biasanya dikemas dengan partikel bulat kecil yang terbuat dari silika yang berlapiskan atau berkaitan dengan fase diam, terutama peka terhadap cemaran. Dengan demikian ekstrak tumbuhan perlu dimurnikan dan disaring sebelum disuntikkan ke dalam pangkal kolom.
KCKT digunakan terutama untuk golongan senyawa takatsiri, misal-nya terpenoid tinggi, segala jenis senyawa fenol, alkaloid, lipid, dan gula. KCKT berhasil paling baik untuk senyawa yang dapat dideteksi di daerah spektrum UV atau spektrum sinar tampak. Satu contoh pemisahan flavonoid dengan KCKT ditunjukkan pada gambar 1.3. Untuk gula yang tidak menunjukkan serapan UV dapat digunakan pendeteksi indeks bias, tetapi kepekaannya lebih rendah. Protein telah dipisahkan dengan KCKT dengan menggunakan kolom 'sephadex' yang dimodifikasi, silika gel, atau penukar ion.
Sebagian besar pemisahan dengan KCKT modern menggunakan kolom siap pakai, dan berbagai jenis kolom ini disediakan oleh pabrik. Tetapi, kebanyakan pemisahan dapat dilakukan dengan menggunakan kolom partikel silika mikropori (untuk senyawa nonpolar) atau kolom fase-balik, yaitu fase-ikat Cig (untuk senyawa polar) (Hamilton dan Sewell, 1982). Satu hal praktis terakhir yang patut disebut-kan yaitu pelarut harus ultramurni dan harus diawagaskan sebelum dipakai.
KCKT merupakan cara kromatografi paling baru yang ditambahkan ke dalam perlengkapan fitokimiawan. Terlepas dari biaya alat dan pelarut, KCKT memberi harapan sebagai alat terpenting dan serba guna pada analisis kuantitatif tumbuhan. Namun demikian, KCKT hams dapat membuktikan kegunaannya pada skala preparatif.
Metode identifikasi
Umum
identifikasi suatu kandungan tumbuhan, setelah kandungan itu oiisolasi dan dimurnikan, pertama-tama harus kita tentukan dahulu golongannya, kemudian barulah ditentukan jenis senyawa dalam golongan tersebut. Sebelum itu, keserbasamaan senyawa tersebut harus diperiksa dengan cermat, artinya senyawa harus membentuk ^ercak tunggal dalam beberapa sistem KLT dan/atau KKt.
Golongan senyawa biasanya dapat ditentukan dengan uji warna, penentuan kelarutan, bilangan Rp, dan ciri spektrum UV. Uji bio-kimia dapat bermanfaat juga: adanya glukosida dapat dipastikan dengan hidrolisis yang menggunakan j & -glukosidase; adanya glukosida minyak amandel dengan hidrolisis yang menggunakan mirosinase, dan sebagainya. Untuk senyawa pengatur tumbuh, uji biologi merupakan bagian identifikasi yang penting.
Identifikasi lengkap dalam golongan senyawa bergantung pada peng-ukuran sifat atau ciri lain, yang kemudian dibandingkan dengan data dalam pustaka. Sifat yang diukur termasuk titik leleh (untuk senyawa padat), titik didih (untuk cairan), putaran optik (untuk senyawa aktif optik), dan Rp atau RRt (pada kondisi baku). Tetapi, data mengenai senyawa tumbuhan yang sama ialah ciri spektrumnya, termasuk pengukuran spektrum UV, inframerah (IM), resonansi magnet inti (RMI), dan spektrum massa (SM). Biasanya senyawa yang pernah diketahui dapat diidentifikasi berdasarkan data di atas. Untuk pemastian akhir harus dilakukan pembandingan langsung dengan senyawa autentik (bila ada). Bila senyawa autentik tidak ada, pembandingan saksama dengan data pustaka sudah cukup untuk identifikasi. Bila menjumpai senyawa baru, semua data di atas sudah cukup untuk menentukan cirinya. Tetapi, untuk senyawa baru, pemastian identitas sebaiknya dengan penguraian kimia atau dengan mensintesis senyawa tersebut.
Identifikasi senyawa tumbuhan baru dengan kristalografi sinar-X sekarang sudah menjadi rutin dan dapat dilakukan bila senyawa itu cukup jumlahnya dan berbentuk kristal. Cara ini terutama sangat bermanfaat pada kasus terpenoid rumit karena dengan cara ini dalam sekali kerja saja kita dapat menentukan sekaligus struktur kimia dan stereokimia.
Sekarang akan dikemukakan ulasan singkat mengenai berbagai cara spektrofotometri itu dan perbandingan peranan masing-masing pada identifikasi fitokimia. Mengenai pembahasan cara spektrofotometri yang lebih terinci, anda dipersilakan membaca salah satu dari se-jumlah buku yang mengupas penggunaan cara spektrofotometri dalam kimia organik (Brandt dan Eglinton, 1965; Williams dan Fleming, 1966; Scheinmann, 1970, 1974).
Sumber :
J.B. Harborne. 2006. Metode Fitokimia.Bandung (terbitan kedua): ITB
0 komentar:
Posting Komentar