Metode pemisahan

Umum

Pemisahan. dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan

dengan menggunakan salah satu dari empat teknik kromatografi atau gabungan teknik tersebut. Keempat teknik kromatografi itu adalah: kromatografi kertas (KKt), kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi gas caw (KGC), dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT).

Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan dan keatsirian senyawa yang akan dipisah. KKf dapat digunakan terutama bagi kandungan tumbuhan yang mudah larut dalam air, yaitu karbohidrat, asam ammo, basa asam nukleat, asam organik, dan senyawa fenolat.

KLT merupakan metode pilihan untuk pemisahan semua kandungan yang larut dalam lipid, yaitu lipid, steroid, karotenoid, kuinon seder-hana, dan klorofil. Sebaliknya, teknik ketiga, yaitu KGC, pengguna-.an utamanya ialah pada pemisahan senyawa atsiri, yaitu asam lemak, mono-dan scskuiterpena, hidrokarbon, dan senyawa belerang. Tetapi, keatsirian kandungan tumbuhan yang bertitik didih tinggi dapat diperbesar dengan mengubahnya menjadi ester dan/atau eter trimetil-silii sehingga hanya ada sedikit saja golongan yang sama sekali tidak cocok untuk dipisahkan dengan cara KGC.

Cara lain, yaitu KCKT, dapat memisahkan kandungan yang keatsiriannya kecil. KCKT adalah suatu metode yang menggabungkan keefisienan kolom dan kecepatan analisis. Di samping itu, perlu dikemukakan bahwa ada tumpang tindih pada penggunaan teknik di atas. Sering gabungan KKt dan KLT, KLT dan KCKT, atau KLT dan KGC mungkin merupakan pendekatan terbaik untuk memisahkan golongan senyawa tumbuhan tertentu.

Semua teknik tersebut dapat digunakan pada skala mikro maupun makro. Untuk pekerjaan penyiapan, KLT dilakukan -pada lapisan penjerap yang tebal, dan KKt pada lembaran kertas saring yang tebal. Untuk isolasi pada skala yang lebih besar dari itu, biasanya digunakan kromatografi kolom yang digabungkan dengan pengumpul fraksi otomatis. Prosedur ini akan menghasilkan senyawa murni dalam skala gram.

Suatu teknik lain yang pemakaiannya agak luas dalam fitokimia ialah elektroforests. Pada mulanya teknik ini hanya dapat digunakan untuk senyawa yang bermuatan, yaitu asam amino, beberapa alkaloid, amina, asam organik, dan protein. Tetapi, selain itu, golongan senyawa netral tertentu (gula, fenol) dapat diusahakan bergerak dalam medan listrik dengan mengubahnya menjadi senyawa kompleks logam (misalnya dengan menggunakan natrium borat). Sargent (1969) telah mcnyusun suatu pengantar teknik elektroforesis yang sederhana.

Di samping teknik yang telah dikemukakan, beberapa teknik lain kadang-kadang digunakan pada penclitian fitokimia. Pemisahan dengan ekstraksi cair-cair sederhana masih tetap bermanfaat di bidang karotenoid (lihat bab 3, h. 161). Alat untuk ekstraksi cair-cair otomatis berupa alat sebar lawan-arus Craig telab ada sejak lama, tetapi ada kecenderungan alat tersebut baru digunakan scbagai usaha akhir bila teknik lain gagal. Alat yang lebih menyenangkan untuk ekstraksi cair-cair telah dikembangkan baru-baru ini, dinamai kro­matografi lawan-arus tetes (KLAT) yang digunakan pada skala pcnyiapan. Penggunaannya tcrutama untuk memisahkan kandungan yang larut dalam air (Hostetmann, 1981). Pemisahan protein tum-buhan dart asam nukleat sering mcmcrlukan teknik khusus yang belum disebutkan, seperti pcnyaringan mclalui gel 'Sephadex', kro-matografi afinitas, dan ultra-pemusingan diferensial.

Karena sudah banyak tulisan mengenai kromatografi (lihat misalnya Heftmann, 1983), di sini hanya diperlukan pembahasan mengenai teknik pcmisahan utama yang digunakan pada penelitian fitokimia dan penunjukan kepada beberapa pustaka pengarah yang mengacu kcpada buku lain yang ada.

Sumber :

J.B. Harborne. 2006. Metode Fitokimia.Bandung (terbitan kedua): ITB